發(fā)酵罐滅菌是確保純種培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，操作不當可能導(dǎo)致雜菌污染、設(shè)備損壞或培養(yǎng)基成分破壞。以下是滅菌過程中需重點注意的事項，按滅菌前準備、滅菌中操作、滅菌后處理三個階段展開說明：

一、滅菌前準備：確保設(shè)備與物料狀態(tài)達標

1. 檢查設(shè)備完整性  

  - 罐體與管路：  

    - 確認罐體無裂縫、焊縫無滲漏（可通過打壓測試，如通入0.1 MPa壓縮空氣，保壓30分鐘，壓力下降＜5%視為合格）；  

    - 管路連接牢固，尤其是蒸汽進口、排氣口、接種口等關(guān)鍵部位，避免蒸汽泄漏導(dǎo)致滅菌不徹-底或人員燙傷。  

  - 傳感器與閥門：  

    - pH電極、溶氧電極需拆卸或用保護套隔離（避免高溫損壞）；  

    - 所有閥門（如進料閥、取樣閥）需處于開啟狀態(tài)（除排氣閥外），確保蒸汽流通無-死角，尤其是死角區(qū)域（如攪拌軸與罐體連接處、噴嘴背側(cè)）。  

2. 培養(yǎng)基預(yù)處理  

  - 成分兼容性：  

    - 避免熱敏性物質(zhì)（如葡萄糖、維生素）與易分解物質(zhì)（如碳酸鈣、銨鹽）直接混合滅菌，可采用“分消法"：先對糖液單獨滅菌（110℃、15分鐘），再與其他成分混合；  

    - 高黏度培養(yǎng)基（如含淀粉、蛋白胨）需適當稀釋或預(yù)攪拌，防止滅菌時形成“固液分層"導(dǎo)致局部滅菌不徹-底。  

  - 裝液量控制：  

    - 實罐滅菌時，培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過罐體容積的70%（預(yù)留蒸汽上升空間），避免滅菌過程中液體隨蒸汽噴出堵塞排氣口。  

3. 空氣過濾系統(tǒng)檢查  

  - 好氧發(fā)酵罐滅菌前需確認空氣過濾器（0.22 μm濾膜）已滅菌或更換（若為一次性濾器），避免滅菌后空氣倒吸時攜帶雜菌；  

  - 關(guān)閉空氣進氣管路閥門，防止滅菌時蒸汽反沖入空氣壓縮機。  

二、滅菌中操作：嚴格控制溫度、壓力與時間

1. 升溫階段：排除冷空氣  

  - 避免“假壓"現(xiàn)象：  

    - 滅菌初期需全開排氣閥，緩慢通入蒸汽，待罐內(nèi)冷空氣完-全排出（排氣口蒸汽呈連續(xù)柱狀、無白霧）后再關(guān)閉排氣閥，開始升壓升溫；  

    - 若未排凈冷空氣，罐內(nèi)實際溫度會低于壓力表對應(yīng)溫度（如0.1 MPa表壓下，含空氣時實際溫度可能僅100℃，而非標準的121℃），導(dǎo)致滅菌不徹-底。  

2. 保溫階段：精準維持滅菌條件  

  - 溫度與壓力匹配：  

    - 濕熱滅菌的標準條件為121℃、0.1 MPa（表壓）維持20~30分鐘（針對50 L以下罐體），大容積罐體需延長至60分鐘以上；  

    - 實時監(jiān)控罐內(nèi)溫度與壓力，確保二者對應(yīng)（如0.05 MPa對應(yīng)108℃，0.15 MPa對應(yīng)128℃），若壓力波動超過±0.02 MPa，需調(diào)整蒸汽流量。  

  - 攪拌與翻動：  

    - 滅菌過程中可低速開啟攪拌（10~20 rpm），推動培養(yǎng)基流動，避免底部沉積固體（如黃豆餅粉）因傳熱不均導(dǎo)致滅菌死角；  

    - 但需注意：攪拌軸封若為機械密封，高溫下可能因潤滑油脂揮發(fā)導(dǎo)致泄漏，小型罐可手動轉(zhuǎn)動攪拌軸代替。  

3. 避免“培養(yǎng)基焦化"  

  - 滅菌時若蒸汽通入過快，可能導(dǎo)致罐體底部局部過熱，培養(yǎng)基中的糖分與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成焦糊物（如葡萄糖焦化后生成5-羥甲基糠醛，抑制菌體生長）；  

  - 預(yù)防措施：控制蒸汽流速，保持罐內(nèi)溫度上升速率≤3℃/分鐘，同時通過罐體夾套或盤管緩慢加熱，而非直接通入蒸汽沖擊底部。  

三、滅菌后處理：防止二次污染與設(shè)備損傷

1. 降壓與冷卻：控制速率防止倒吸  

  - 緩慢降壓：  

    - 滅菌結(jié)束后，先關(guān)閉蒸汽閥門，待罐內(nèi)壓力自然降至0.05 MPa以下，再緩慢開啟排氣閥（開度≤50%），避免因壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基沸騰噴料；  

    - 好氧發(fā)酵罐需在壓力降至接近零前，提前通入無菌空氣（經(jīng)0.22 μm濾膜過濾），維持罐內(nèi)正壓（0.01~0.03 MPa），防止外界空氣倒吸帶入雜菌。  

  - 冷卻方式選擇：  

    - 優(yōu)先采用夾套或盤管通水冷卻（水溫≤20℃），避免直接向罐體噴淋冷水（可能導(dǎo)致罐體驟冷變形，尤其玻璃罐易炸裂）；  

    - 冷卻過程中需持續(xù)監(jiān)測罐內(nèi)壓力，若壓力過低（接近負壓），需補充無菌空氣或氮氣。  

2. 無菌操作銜接  

  - 接種與取樣：  

    - 滅菌后所有操作需在火焰保護下進行（如接種時將接種口置于酒精燈火焰旁，快速打開并接入菌種）；  

    - 取樣閥需先用75%酒精擦拭，再用火焰灼燒滅菌，取樣后立即關(guān)閉閥門。  

  - 過濾器與管路維護：  

    - 空氣過濾器在滅菌后需檢查完整性（如進行氣泡點測試：將濾膜浸入乙醇，通入空氣，觀察氣泡產(chǎn)生時的壓力是否≥設(shè)計值的80%）；  

    - 管路若需拆開（如連接補料泵），接口處需用滅菌紗布包裹，或重新用酒精棉球擦拭滅菌。  

3. 設(shè)備清洗與保養(yǎng)  

  - 及時清洗：  

    - 滅菌后若培養(yǎng)基殘留罐壁或攪拌槳，需趁熱用溫水（40~50℃）沖洗（避免冷卻后固形物黏附難以清除），再用氫氧化鈉溶液（1%~2%）浸泡30分鐘，最后用清水沖至中性；  

    - 不銹鋼罐體避免使用鋼絲球擦洗，以防刮傷表面鈍化層，可用尼龍刷或海綿。  

  - 部件檢查：  

    - 檢查密封墊片（如O型圈）是否因高溫老化變形，若有裂紋需及時更換；  

    - 校準溫度傳感器、壓力表（每年至少一次），確保下一批次滅菌參數(shù)準確。  

四、特殊場景注意事項

1. 基因工程菌發(fā)酵罐  

  - 滅菌前需確認生物安全閥門已開啟（如帶有雙重密封的排氣閥），滅菌后排氣需經(jīng)高效過濾器（HEPA）處理，防止工程菌隨蒸汽擴散；  

  - 若使用一次性發(fā)酵袋，滅菌方式改為輻照滅菌（如鈷-60照射），避免蒸汽濕熱破壞塑料材質(zhì)。  

2. 厭氧發(fā)酵罐滅菌  

  - 滅菌后需快速建立厭氧環(huán)境：通入氮氣置換罐內(nèi)空氣（3次以上），使氧氣含量＜0.1%（通過氧化還原電位計監(jiān)測）；  

  - 接種時采用“氮氣保護接種法"，通過無菌管路將菌種壓入罐內(nèi)，避免接觸空氣。  

3. 連續(xù)滅菌（連消）系統(tǒng)  

  - 需同步滅菌連消塔、維持罐與換熱器，確保各段溫度達標（如連消塔出口溫度135℃，維持罐停留時間5分鐘）；  

  - 滅菌結(jié)束后，用無菌水沖洗管路，防止培養(yǎng)基殘留滋生嗜熱菌（如嗜熱脂肪芽孢桿菌）。 

滅菌失敗的常見原因與應(yīng)對

（一）

問題類型：雜菌污染

可能原因：排氣不徹-底、濾膜破損、滅菌時間不足

解決措施：重新滅菌，檢查濾器完整性，延長保溫時間

（二）

問題類型：培養(yǎng)基碳化

可能原因：蒸汽通入過快、底部積料

解決措施：控制升溫速率，滅菌前攪拌均勻物料

（三）

問題類型：設(shè)備腐蝕/變形

可能原因：高溫下密封件老化、驟冷驟熱

解決措施：定期更換密封件，采用梯度冷卻

（四）

問題類型：傳感器失靈

可能原因：滅菌時未拆卸或保護不當

解決措施：滅菌前移除精密傳感器，使用耐高溫替代探頭

發(fā)酵罐滅菌需遵循“徹-底性、安全性、經(jīng)濟性"原則，通過標準化操作流程（SOP）與實時監(jiān)控（如溫度曲線記錄），將滅菌成功率提升至99%以上，為后續(xù)發(fā)酵過程奠定基礎(chǔ)。